Introducción
En la naturaleza y la mayor parte de las secreciones corporales los microorganismos viven mezclados o en comunidades. Para poder determinar las características de un microorganismo, este debe ser aislado en un cultivo puro o Axénico. El procedimiento consiste en usar un medio de cultivo, realizar la siembra adecuada, usar el medio de cultivo especifico y darle las condiciones o factores ambientales como nutrientes, temperatura, PH, etc., que estimulen y favorezcan el crecimiento del organismo que se quiera aislar. Una vez que hayan crecido los microorganismos si el cultivo está mezclado con varios microorganismos hay que purificarlo, es decir aislar o pasar cada microorganismo a otro medio de cultivo mediante un repique para poder así trabajar con cultivos puros o axenicos.
Sembrar o inocular: es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril.
Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los contiene de varios tipos. En hábitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los tipos de microorganismos presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando los microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población. Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se identifica.
Cultivo mixto o contaminado: es aquel que contiene dos o mas microorganismos de diferente tamaño y morfología
Cultivo puro o axénico: es aquel que posee un sol microorganismo. Siempre se debe trabajar con cultivos puros.
TIPOS DE SIEMBRAS
1. Siembras en medios líquidos:
Con el asa redonda se toman varias colonias y se transfieren al medio de cultivo líquido. El medio líquido sin inocular normalmente es transparente. Después de 18- 24 horas de incubación el crecimiento microbiano en un medio liquido se puede manifestar por: enturbiamiento, flóculos o grumos, formación de velo o película, anillos en la parte superior, o por sedimento.
2. Siembras en medios sólidos: estas pueden ser en tubos o placas o cajas de petry.
Siembras en tubos:
a) Tubos con agar inclinado: Para sembrarlos, se introduce el asa en punta hasta el fondo del tubo, y al sacar el asa se pasa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar.
El crecimiento sobre la superficie del agar inclinado se puede observar de varias formas: ramificado, puntiforme, puntiaguda, uniforme, rizoide, extendido como lo muestra la ilustración.
b) Tubos sin bisel o inclinación: Se siembran introduciendo un asa en punta en el centro del agar hasta la mitad del tubo. También se llama siembra por picadura. Esta siembra es muy utilizada para observar la movilidad de las bacterias generalmente en agar semisólido. La movilidad se observara como un enturbiamiento alrededor de la punción:
3) Siembras en cajas de petry: existen varias técnicas para el aislamiento de microorganismos en cajas de petry: por estrías o agotamiento (para obtener colonias aislar y/o cultivos puros o axénicos), por exposición de superficie (para pescar microorganismos ambientales), en superficie por diseminación, siembra en profundidad o vertido en placa (estas dos últimas muy utilizadas para el aislamiento de patógenos industriales), y con escobillones a partir de secreciones corporales:
a) siembras por estrías o agotamiento: Se siembra con un asa redonda con el objetivo de aislar el microorganismo:
1. Con el mechero prendido esterilizar el asa redonda, se toca una colonia (no agarre ni coja gran cantidad de inoculo)(1), o tomar una pequeña alicuota de un tubo como lo representa el dibujo:
Posteriormente se procede a hacer la técnica del aislamiento del microorganismo o técnica por agotamiento de la siguiente manera:
Extender o desplazar el asa de extremo a extremo sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar sólido en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar (1). Luego se esteriliza el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada en el cuadrante 1, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías (2). Este proceso se repite sucesivamente pero sin volver a flamear y tratando de no tocar la ultima estría que se realizo(3 y 4). Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada generalmente entre 35
b) siembra en superficie o por diseminación: con pipeta estéril se deposita la muestra (generalmente 0.1 ml) de la dilución en el centro de la placa, y se distribuye en la superficie del agar con un rastrillo de vidrio estéril o asa de Jokey. Se incuba la caja y al siguiente día se observaran las colonias totalmente distribuidas sobre la superficie del agar:
c) Siembra en profundidad o vertido en placa: En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra o dilución de un microorganismo (generalmente 1cc), y a continuación se añade 20 CC de medio de cultivo fundido y atemperado a
d) Siembra por exposición de superficie: muy utilizada para pescar microorganismos ambientales, en sitios donde no son permitidos: procesadoras de alimentos, quirófanos, fabricas de empacado de drogas o alimentos, etc. Para tal fin se deja la caja de petri con agar Plate count destapada durante 10- 20 minutos, posteriormente se lleva a incubación por 18-24 horas para observar crecimiento de patógenos ambientales:
e) Siembra con un hisopo o escobillon a partir de secreciones corporales: se coge la muestra con el escobillon y en un lado o extremo de la caja de petri se hace una siembra en formas de botón(1). Luego se esteriliza y se enfría el asa redonda y se procede a hacer la siembra por estrías y agotamiento para distribuir uniforme la muestra sobre la superficie del agar para obtener colonias aisladas, y observar si hay uno o varios microorganismos en dicha muestra(2,3 y 4). En caso de que se obtuviera un cultivo mixto o con varios microorganismos, se procederá a aislar cada uno de ellos con el fin de obtener cultivos puros para el estudio del agente patógeno:
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Siembras de Hongos
A) Hongos miceliales o mohos: para sembrarlos se utiliza un asa en punta y dura especialmente diseñada para la siembra de estos hongos. Se agarra una pequeña cantidad del hongo a sembrar y en medios de cultivos para hongos (PDA, Micosel, Sabouraud etc.) se hace un enterramiento de la muestra(1). La temperatura optima de crecimiento de estos hongos es la del medio ambiente: 20-25ªC y se deben dejar mínimo una semana pues los hongos son de lento crecimiento.
B) Hongos levaduriformes: dada las características macroscópicas del crecimiento de estos hongos, la siembra se realiza con el asa redonda y por estrías y agotamiento para obtener colonias aisladas(2). Se deben incubara temperatura ambiente y también son de crecimiento lento.
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