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Introducción

En  la  naturaleza  y  la  mayor  parte  de  las  secreciones  corporales  los  microorganismos  viven  mezclados  o  en  comunidades. Para  poder  determinar  las  características  de  un  microorganismo,  este  debe  ser   aislado  en un  cultivo  puro  o  Axénico. El  procedimiento  consiste  en  usar  un  medio  de  cultivo, realizar  la  siembra  adecuada, usar  el  medio  de  cultivo especifico y  darle las  condiciones  o  factores  ambientales  como  nutrientes, temperatura, PH, etc., que  estimulen  y  favorezcan  el  crecimiento del organismo  que  se  quiera  aislar. Una  vez  que  hayan  crecido  los  microorganismos si  el  cultivo  está  mezclado  con  varios  microorganismos  hay  que  purificarlo,  es  decir  aislar  o  pasar  cada  microorganismo a  otro  medio  de cultivo mediante un repique para  poder  así trabajar  con  cultivos  puros  o  axenicos. 

Sembrar o inocular: es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril.

Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los contiene de varios tipos. En hábitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los tipos de microorganismos presentes. El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando los microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un procedimiento llamado  búsqueda que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población. Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se identifica.

Cultivo  mixto  o  contaminado: es  aquel  que  contiene  dos  o  mas  microorganismos  de  diferente  tamaño  y  morfología

Cultivo puro o  axénico: es  aquel  que  posee un  sol microorganismo.  Siempre se  debe  trabajar  con  cultivos  puros.   

TIPOS  DE SIEMBRAS

1. Siembras  en  medios  líquidos:

Con  el  asa redonda se toman varias  colonias y  se  transfieren al  medio de  cultivo líquido. El medio  líquido  sin  inocular normalmente  es  transparente. Después  de  18- 24 horas  de  incubación el crecimiento microbiano  en  un  medio liquido se puede manifestar por: enturbiamiento, flóculos o grumos, formación de velo o película, anillos  en la  parte  superior, o por sedimento.

2. Siembras en medios sólidos: estas  pueden ser en tubos o placas o  cajas  de  petry.

Siembras  en  tubos:

a)    Tubos con agar inclinado: Para sembrarlos, se introduce  el asa en punta hasta  el  fondo  del  tubo, y  al sacar  el  asa se pasa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar.

El  crecimiento  sobre  la  superficie  del  agar  inclinado  se puede  observar de  varias  formas: ramificado, puntiforme, puntiaguda, uniforme, rizoide, extendido como  lo  muestra  la  ilustración.

b) Tubos sin bisel o inclinación: Se siembran introduciendo un asa  en punta en el centro del agar hasta  la  mitad  del  tubo. También se llama siembra por picadura. Esta  siembra es  muy  utilizada  para  observar  la  movilidad  de  las  bacterias generalmente  en  agar  semisólido. La  movilidad  se  observara  como  un  enturbiamiento  alrededor  de  la  punción:


3) Siembras en cajas de  petry: existen  varias  técnicas  para  el  aislamiento  de  microorganismos  en cajas  de  petry: por  estrías  o  agotamiento (para  obtener  colonias  aislar y/o cultivos  puros  o  axénicos), por  exposición de superficie (para  pescar  microorganismos  ambientales), en  superficie por  diseminaciónsiembra  en  profundidad o  vertido  en placa (estas  dos  últimas  muy  utilizadas  para  el  aislamiento  de  patógenos industriales), y con  escobillones a partir  de  secreciones  corporales:  

a) siembras por  estrías  o  agotamiento: Se siembra con un asa redonda con  el  objetivo de aislar el microorganismo:

1. Con  el  mechero  prendido esterilizar el asa redonda, se toca una  colonia  (no  agarre ni  coja   gran  cantidad  de inoculo)(1), o tomar  una  pequeña  alicuota de un  tubo como  lo  representa  el  dibujo:

Posteriormente se procede a  hacer  la  técnica  del  aislamiento  del  microorganismo  o  técnica por  agotamiento de  la  siguiente  manera:

Extender o  desplazar  el  asa de  extremo a  extremo sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar sólido en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar (1).  Luego  se  esteriliza el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada en  el  cuadrante 1, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías (2). Este proceso se repite sucesivamente pero  sin  volver  a  flamear y  tratando  de  no  tocar  la  ultima  estría  que se  realizo(3 y 4). Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada generalmente  entre 35 -37ºC, siempre con  la  tapa invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra o  un  cultivo que contenga un elevado número de gérmenes:

b) siembra en superficie o por  diseminación: con pipeta estéril se  deposita   la  muestra (generalmente 0.1 ml) de la dilución en el centro de la placa, y se distribuye en  la  superficie  del  agar con un rastrillo de vidrio estéril o  asa  de  Jokey. Se  incuba la  caja y  al  siguiente  día  se  observaran  las  colonias totalmente distribuidas  sobre  la  superficie  del  agar:

c) Siembra  en  profundidad o  vertido  en placa: En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra o  dilución  de un microorganismo (generalmente 1cc), y a continuación se añade 20 CC de medio de cultivo fundido y atemperado a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los  microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Esta siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar y  aislar  microorganismos, sino además para contar el  número  de  patógenos  existentes  en  la  muestra  analizada: 

d) Siembra por  exposición de superficie: muy  utilizada  para  pescar microorganismos  ambientales, en  sitios  donde  no  son permitidos: procesadoras  de  alimentos, quirófanos, fabricas  de  empacado  de  drogas  o  alimentos, etc. Para  tal  fin  se  deja  la  caja   de petri con  agar  Plate count destapada  durante  10- 20  minutos, posteriormente  se lleva  a incubación por  18-24 horas para  observar  crecimiento  de  patógenos  ambientales:   

e) Siembra con un hisopo o  escobillon   a partir  de  secreciones  corporales: se  coge  la  muestra con  el  escobillon y  en  un  lado o  extremo de  la  caja  de  petri  se  hace una  siembra  en  formas  de  botón(1). Luego  se  esteriliza  y  se  enfría  el  asa  redonda y  se  procede   a hacer  la  siembra  por estrías y  agotamiento para  distribuir  uniforme la  muestra sobre  la  superficie  del  agar para  obtener  colonias  aisladas,  y   observar  si  hay  uno  o varios  microorganismos  en  dicha  muestra(2,3 y 4).  En  caso  de  que  se  obtuviera  un  cultivo   mixto o  con  varios  microorganismos,  se  procederá  a  aislar  cada  uno  de  ellos  con  el  fin  de  obtener  cultivos  puros para  el  estudio  del  agente  patógeno:

                                

                                1                             2                                3                                  4

Siembras de Hongos

A) Hongos  miceliales  o mohos: para  sembrarlos  se  utiliza  un  asa en  punta  y  dura especialmente  diseñada para  la  siembra  de  estos hongos. Se  agarra  una  pequeña cantidad  del  hongo  a  sembrar  y  en  medios  de  cultivos  para  hongos (PDA, Micosel, Sabouraud etc.) se  hace  un  enterramiento  de  la  muestra(1). La  temperatura  optima  de  crecimiento  de  estos  hongos  es  la del  medio  ambiente: 20-25ªC y  se  deben  dejar  mínimo  una  semana  pues  los  hongos  son  de  lento crecimiento.

B) Hongos  levaduriformes: dada  las  características  macroscópicas  del  crecimiento  de  estos  hongos, la  siembra  se  realiza  con  el  asa redonda  y  por  estrías  y  agotamiento  para  obtener colonias  aisladas(2). Se  deben  incubara  temperatura  ambiente  y  también  son  de  crecimiento  lento.

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